新科技！高效减少组织自发荧光——提高免疫荧光分析中的信噪比
免疫荧光技术是现代生物学和医学中的常用的一种实验技术一般需要实验试剂，实验仪器乐发2。该方法灵敏度高，可使用荧光显微镜对组织样本进行分析。该技术利用荧光分子标记的抗体对与之相结合的抗原进行定位，可对蛋白质、聚糖蛋白、小生物分子和非生物分子进行清晰的亚细胞可视化研究。但是，组织中的自发荧光往往会严重干扰这一技术的发展。如这篇文章所述，目前，已经研发出一项技术，其可显着降低组织的自发荧光，提高染色结果的信噪比。自发荧光是指在免疫荧光检测过程中产生的与目的信号无关的、背景荧光信号的统称。组织切片中的红细胞（RBCs）和胶原蛋白等成分可产生很强的自发荧光，其严重影响目的信号的辨别。此外，组织固定中使用的福尔马林、多聚甲醛等物质也能产生大量的自发荧光。自发荧光是指在免疫荧光检测过程中产生的与目的信号无关的、背景荧光信号的统称。组织切片中的红细胞（RBCs）和胶原蛋白等成分可产生很强的自发荧光，其严重影响目的信号的辨别。此外，组织固定中使用的福尔马林、多聚甲醛等物质也能产生大量的自发荧光。自发荧光是指在免疫荧光检测过程中产生的与目的信号无关的、背景荧光信号的统称。组织切片中的红细胞（RBCs）和胶原蛋白等成分可产生很强的自发荧光，其严重影响目的信号的辨别。此外，组织固定中使用的福尔马林、多聚甲醛等物质也能产生大量的自发荧光。自发荧光是指在免疫荧光检测过程中产生的与目的信号无关的、背景荧光信号的统称。组织切片中的红细胞（RBCs）和胶原蛋白等成分可产生很强的自发荧光，其严重影响目的信号的辨别。此外，组织固定中使用的福尔马林、多聚甲醛等物质也能产生大量的自发荧光。
乐发2自发荧光是指在免疫荧光检测过程中产生的与目的信号无关的、背景荧光信号的统称。组织切片中的红细胞（RBCs）和胶原蛋白等成分可产生很强的自发荧光，其严重影响目的信号的辨别。此外，组织固定中使用的福尔马林、多聚甲醛等物质也能产生大量的自发荧光。组织产生的自发荧光对组织切片的检测结果造成了很大的困扰，尤其对使用绿色和红色通道荧光的检测。尽管目前的技术手段已经避免了红色/远红外波长产生的自发荧光，但某些情况下，在600-700nm波长范围内仍然可能产生组织的自发荧光。组织自发荧光产生的原因主要来自于组织本身的组分。主要包括黄素、卟啉、植物叶绿素、胶原蛋白、弹性蛋白、红细胞和脂褐素等。这些组分通常在可见光谱的绿色和黄色波长范围内产生荧光。而免疫荧光技术中最常用的荧光染料是绿色波长通道的荧光素和Alexa Fluor 488（Thermo Fisher Scientific）。组织中这些天然成分发出的自发荧光显著影响实验结果的信噪比。除去组织切片自身的原因，组织固定中经常使用的甲醛、戊二醛和福尔马林等也会造成组织的自发荧光。由于固定剂本身造成的高背景荧光，许多使用福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的组织样品，尤其是肾脏/脾脏的组织样本，非常不适用于免疫荧光检测。这是由于福尔马林可在蓝色、绿色和红色波长光谱范围上产生大量的自发荧光。
目前，关于由组织固定导致自发荧光显著增加的机理尚不清楚。甲醛和戊二醛均可通过形成共价交联来稳定组织结构。由于与醛反应的蛋白侧链种类繁多，反应动力学、可逆性以及交联剂复杂的化学性质使得产生交联的化学结构各异。这可能也是导致自发荧光机理尚不明确的主要原因之一。FFPE组织中产生的自发荧光很可能是由于C = C键或C = N键的存在。为了解决这一问题，有些研究，利用硼氢化钠来还原C = C和C = N键以减少组织的自发荧光。然而，硼氢化物和与之类似的还原剂在中性pH环境下很不稳定。研究人员发现，尽管硼氢化钠可成功的减少组织中的一些自发荧光，但该方法的可重现性低、试剂处理难度很大。用于减少组织自发荧光的另外一种方法是光漂白。使用该方法时，组织切片长时间暴露于高强度UV辐射下，组织中的成分发生不可逆的光氧化作用。有研究证明，光漂白与其他处理结合使用可有效的降低自发荧光。但该方法耗时太长。另外，大多数免疫组化实验室均缺乏光漂白方法所需的仪器设备。历史上，用于降低组织自发荧光的主要方法是用苏丹黑或类似的非荧光重氮染料溶液处理组织。这些疏水染料可与组织切片进行非特异性结合，结合后的染料（苏丹黑）通过吸收入射光来降低组织的自发荧光（暗淬灭）。具体来说，苏丹黑对降低组织中由脂褐素引起的自发荧光非常有效。脂褐素是一种很明亮的荧光色素，在一些组织中随着年龄的增长而积累。脂褐素颗粒由目前，一种减少组织切片自发荧光的新技术已经应运而生。该方法可显著减少由于福尔马林固定、胶原蛋白、弹性蛋白和红细胞导致的自发荧光。这项新技术以Vector由于TrueVIEW Quencher的亲水性特征，组织切片的处理也是在水溶性缓冲液中进行的，因此并不需要70％乙醇预处理步骤。 此外，在免疫荧光实验结束时，只需使用TrueVIEW Quencher处理两分钟即可。更重要的是，TrueVIEW淬灭剂可与常见的大部分荧光基团兼容，例如荧光素、Alexa荧光剂、DyLight荧光剂、Cyanine荧光剂以及绿色荧光蛋白等。TrueView Quencher处理方法的实用性已在脾脏组织（Fig1A和1B）和胰腺组织（图1C和1D） 的实验结果中得到证实。未经处理的脾脏组织，在绿色通道中发生了很强的自发荧光，这些自发荧光严重干扰了Ki67的信号（图1A）。经TrueView Quencher处理后，在黑色背景中，可清晰看到Ki67的亮绿色的目的信号（图1B）。此外，图1还证明了使用TrueView Quencher处理胰腺组织的有效性：经处理后，组织中绿色和红色波长处的自发背景荧光大大降低（图1C和1D）。 图2证实了TureView Quencher可降低肾组织中绿色和红色自发背景荧光，并可保证其正常的DAPI（蓝色通道）核染色。
